25 ноября 2024 г. фото: РИА Новости/Константин Михальчевский Команда исследователей кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ сравнила эффективность двух версий технологии CRISPR-Sirius, предназначенной для визуализации локусов хроматина в живых клетках: MS2/MCP-sfGFP и PP7/PCP-sfGFP . . Результаты показали, что использование версии MS2/MCP-sfGFP позволило добиться более высокой эффективности визуализации. В ходе исследования авторы также проанализировали эффективность различных методов доставки генов направляющих РНК: лентивирусной трансдукции и транзиентной трансфекции. Первый подход показал лучшие результаты. По результатам работы составлен список границ топологически связанных доменов (ТАД), для исследования которых может быть использована технология CRISPR-Сириус. Об этом сообщила пресс-служба вуза.
Результаты научной работы были опубликованы в журнале Cells.
Как известно, наследственная информация закодирована в последовательностях молекул ДНК, общий размер которых в клетках человека составляет примерно два метра. Чтобы ДНК поместилась в ядро клетки, она подвергается значительному уплотнению с участием различных белков. Совокупность ДНК и белков, которые с ней взаимодействуют, называется хроматином. Сейчас ясно, что хроматин — это не случайная запутанная смесь ДНК и белков, а сложная и иерархически организованная система. Кроме того, такая система очень динамична: участки хроматина могут перемещаться внутри ядра и взаимодействовать друг с другом и другими внутриядерными структурами. Такая динамика важна для регуляции экспрессии генов, размножения и восстановления повреждений в молекулах ДНК (ремонт).
Для изучения динамики хроматина необходимы методы, которые позволят визуализировать точечные локусы хроматина (например, отдельные гены или регуляторные элементы генома) и отслеживать их перемещения в ядре живой клетки.
К таким методам относится только что описанная технология (система визуализации) CRISPR-Сириус. Эта система состоит из трех компонентов. Первый компонент представляет собой каталитически неактивный вариант нуклеазы Cas, dCas9. Второй компонент представляет собой направляющую РНК, которая направляет dCas9 к целевому локусу хроматина. В системе CRISPR-Sirius направляющая РНК содержит восемь шпилек бактериофага MS2 или PP7. Такие шпильки распознаются белками MCP и PCP соответственно, которые связаны с флуоресцентным белком (например, sfGFP). Таким образом, когда в клетке экспрессируются все три компонента — dCas9, направляющая РНК и белки MCP или PCP — в целевом локусе образуется флуоресцентный комплекс, который делает этот локус видимым под микроскопом.
Несмотря на доказанную эффективность описанного метода, необходимы исследования, которые бы сравнили производительность системы CRISPR-Sirius по выбору одного из белков: MCP или PCP. Используя набор из нескольких мишеней, группа учёных кафедры молекулярной биологии МГУ сравнила эффективность этих двух версий системы. Команда также проанализировала эффективность двух разных методов доставки генов направляющей РНК в клетки — с помощью лентивирусной трансдукции и временной трансфекции (липофекции). Первый метод заключается в доставке материала с помощью лентивирусных частиц, второй — с помощью липидных везикул.
Показано, что система CRISPR-Sirius, использующая шпильки MS2 в направляющей РНК и белок MCP-sfGFP, обеспечивает значительно более высокую эффективность визуализации целей, чем версия PP7/PCP-sfGFP. Ученые также определили, что доставка генов направляющей РНК с помощью лентивирусных частиц приводит к лучшим результатам. В ходе работы был выявлен набор локусов — границ топологически связанных доменов, которые можно визуализировать с помощью технологии CRISPR-Sirius. Топологически ассоциированные домены (TAD) представляют собой основную единицу уплотнения хроматина в клетках человека и других животных. Использование технологии CRISPR-Sirius для визуализации TAD в будущем позволит нам лучше понять закономерности формирования этих структур и механизмы компактизации и динамики хроматина в целом.
«Несмотря на то, что в последние годы активно развиваются технологии визуализации хроматина в живых клетках, эффективность их использования на практике может быть достаточно низкой. Такие технологии требуют доставки в клетки и экспрессии нескольких генов (dCas9, гидовых РНК, флуоресцентных белков), подбор подходящих целевых локусов и подбор условий микроскопии живых клеток. Оптимизация этих параметров — трудоемкий процесс, на достижение которого у нас ушло почти два года. визуализация с использованием технологии CRISPR-Sirius. Эта технология ранее была опубликована в авторитетном журнале, но мы заметили, что некоторые практические аспекты ее применения остались недостаточно освещенными. В нашей работе мы описали трудности, связанные с использованием CRISPR-Sirius. технологии, выбрал наиболее эффективный вариант этой системы и предложил список локусов — границ топологически связанных доменов, которые можно успешно визуализировать с помощью этой технологии. Наша публикация носит вполне технический характер, но мы уверены, что он будет полезен широкому кругу исследователей, занимающихся синтетической биологией и визуализацией хроматина», — резюмирует Владимир Вьюшков, научный сотрудник кафедры молекулярной биологии биологического факультета, Москва. Государственный университет.
-сообщает icmos.ru #Биологи #МГУ #определили #самый #эффективный #способ #визуализации #хроматина #клетках Читать, как было на самом деле:
....закрыть ▲
